补体能使抗体致敏的羊红细胞发生溶血反应,根据溶血程度可测定补体总活性.以溶血百分率作纵坐标,相应的血清量为横坐标绘图,可知在50%溶血附近补体的量与溶血程度呈直线%溶血作为终点更为.故称为50%溶血试验,即 CH50(50%complementhemolysis).
(1)绵羊红细胞(sheepredbloodcell,SRBC) 自绵羊颈静脉采血,注入装有等量或二倍量阿氏(Alsever)液的无菌三角烧瓶中,轻摇3-5min,分装,4℃保存,可用2-3周左右.试验时,取一定量的SRBC用生理盐水洗涤3次,最后1次洗涤离心的条件每次试验要保持一致.试验时一般配成1×109SRBC/ml.为使每次试验时SRBC的浓度标准化,可根据经细胞计数器校准的浓度为1×109SRBC/ml的细胞悬液,用分光光度计测定其OD541nm值,以后每次试验均参照此OD值校正 SRBC浓度;
(2)溶血素(hemolysin) 即抗SRBC抗体,是以SRBC作为抗原免疫家兔所得.有商品出售,可按标示效价计算单位和稀释使用,也可自行制备和滴定;
(4)致敏SRBC 取2个单位的溶血素与1X109SRBC/ml悬液等量混和,放37℃水浴30min.温育过程中应经常摇动.致敏后用TEAE缓冲液洗涤3次后,制成5X10u/ml浓度的致敏SRBC悬液.
先配制50%溶血标准管,在各试管中加入反应物,放37℃水浴60rain,以2000r/min离心10min;再与50%溶血标准管比较,观察溶血程度.
取与50%溶血标准管相接近的二管在分光光度计上分别读取OD541nm值,以最接近50%溶血标准管OD值的一管,按下列公式求得50%溶血的总补体活性值.血清总补体活性(CH50)=1/(血清用量×稀释倍数).本法测得血清总补体活性的正常值为30～40CH50U/ml.
上述补体总活性CH50测定方法由于每次试验需使用新鲜SRBC,细胞与细胞的批间差异也常因动物的个体和采血时间而异,且又是一种半定量的人工操作试验,迄今难以令人满意.1995年日本学者Yamamoto等创建一种脂质体均相免疫溶破试验,用于血清总补体活性测定.并由Wako公司研制成诊断试剂盒,包括两种试剂:试剂1为脂质体,它是由一个极性部分(磷脂中的胆碱)和一个非极性部分(磷脂中的烷基)组成的封闭性颗粒.在脂质体的内部水相中包入水溶性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH);在其脂质体双层内包裹抗原——二硝基苯酚(DNP).试剂2为羊抗DNP抗体和酶底物—— 24mmol/L 6·磷酸萄萄糖(G6P)和9mmol/LNAD(辅酶1).
试验方法分为两步:(1)将10ml血清样品与250pL脂质体(试剂1)混合,作用5min;(2)加入抗体和酶底物(试剂2)125ml,混匀.反应4.5～5min,用自动分光光度分析仪340nm波长测定酶反应物的吸光度.反应过程为试剂2中的抗DNP抗体与脂质体上的抗原(DNP)结合,形成抗原—抗体复合物,血清样品中的补体被激活,并脂质体的膜.脂质体膜溶破后出的G-6-PDH与酶底物的G6P和NAD发生反应,产生的NADH在340nm测定其吸光度(A).A值与血清样品中补体活性成一定比例关系.该法与经典的CH50溶血法对比测定结果的相关系数为 r:0.87-0.923,且方法简便,快速准确,血清用量少,适用于自动分析仪测定.
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