3、取0.1ml抗凝血,加入到含1ml培养液的培养瓶中,每个血样接2~3个培养瓶.如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血,加入培养瓶中更好.
5、培养结束后,将培养物移到离心管内,用3%冰醋酸6ml,分两次冲洗培养瓶,并将冲洗液也装入离心瓶中,2 000r/min离心10min,去上清.沉淀再用3%冰醋酸洗涤一次,同样离心去上清.
6、在沉淀中加30%H2O2液一滴,85℃水浴15min,待溶液呈无色时,再加甲酸0.5ml,继续加热(85℃)30min,使沉淀物完全消化溶解.
7、将消化溶解的液体移入测样杯内,用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积少于0.1ml,加闪烁液5ml,用液体闪烁液计数器测其脉冲数.
8、第5~7步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备.即:培养结束后,将培养液移入离心管,2000r/min离心10min,弃上清,沉淀用生 理盐水洗涤一次、再离心.将沉淀移至滤膜上(注意将沉淀全部移入),减压抽滤,并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸(若有带色物质,用30%H2O2液脱色)和3ml无水乙醇抽滤.取出滤膜,60℃~80℃烘干,然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上),用液体闪烁液计数器检测.
以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm.取各管测定读数的平均值,即为0.1ml血样的脉冲数.全血检测的脉冲数,再按血样淋巴细胞计数结果,校 正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞).也可以刺激指数(SI)表示试验结果.为此须在培养时,设同样数量的不加PHA的对照培养瓶,试 验管脉冲数与对脉冲数之比,即为刺激指数.
2、培养细胞时,可放入CO2培养箱中培养,也可在普通温箱进行培养,但一定要把盖子拧紧,否则结果差别较大.
3、以SI表示结果时,一定要设置相同数量培养管的对照(即不加PHA).而以cpm绝对值表示(cpm/106淋巴细胞)则可以不用设对.因为对照的cpm与本底比较接近,不同样品之间的少许差别也不易确定其意义.
4、闪烁液的容水量很低,所以在加入闪烁液之前必须烘干.但加入一定量的醇类(如无水乙醇),则可容纳少量的处理后所残留的水分,但也仍需烘至接近 干燥的程度,否则将发生浑浊而无法测定.据报道,如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇(TritonX-100),其容水量可达15%,消化溶 解后的样品,不必烘干,即可添加闪烁液测定.
最新评论