MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下 tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT还原).还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目.也可以用DMSO来溶解.
MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好.
用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.
培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ulDMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解.
选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔内培养液.
3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照.其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零.
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线是半率,意思是率50%的时候药物的浓度.把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的率,以药品的浓度为横坐标,率为纵坐标作图,然后得到50%率时候的药品浓度,就是IC50.要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!
一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值.
一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多.我一般用1/2-1/3的IC50,作用时间为36h.一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%(Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显.
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