摘要：对生物合成过程进行标记,主要是为了研究蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程.
对生物合成过程进行标记,主要是为了研究蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程.通常将细胞放在含有充足营养成分和放射性标记氨基酸的培养基中,虽然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白质中的含量较低,但其35S标记物具有性高(>2.93 ×1013 Bq/mmol) 、容易检测的特点,因此是进行生物合成标记的首选氨基酸.下列步骤是对悬浮液中细胞(脾或胸腺的单细胞悬浮液或者培养物)进行短期标记的方法.
2. 在锥形离心管中,用10ml 37 ℃的标记培养基洗涤细胞,然后300 × g 离心5 分钟;
1. 洗涤后的细胞, 用37 ℃预热的标记培养基重新悬浮 (4 ml含 20 ×106个细胞) ,在37 ℃孵育 30分钟,间歇漩涡振荡,以耗尽细胞内原有的蛋氨酸和半胱氨酸;
3. 注意: [35S] 蛋氨酸容易挥发,请在专用的、装有活性炭过滤器的通风橱内,打开[35S] 蛋氨酸储存液.目前,不易挥发的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸均有商品出售.
3. 细胞放入37 ℃恒温箱中,孵育30 分钟到 3 小时,孵育期间经常振荡,以保持细胞悬浮;
7. 按“细胞提取液的制备”(见Protocol 43)中的方法进行细胞处理和分析,或者-20 ℃冻存细胞.
1. 如果脉冲需要持续1小时以上,需要在无菌的条件下,向标记培养基中添加2% 的胎牛血清和2%的 L-谷氨酸;
2. 对于大多数类型的细胞,可以采用带螺口的组织培养瓶,并在湿润的、含5% CO2的培养箱中进行孵育;
4. 也可以使用14C-标记的氨基酸作标记,其半衰期长,有利于在较长的时间(几个星期)内使用标记的蛋白质, 例如标记杂交瘤B细胞分泌的单克隆抗体,就常采用14C-标记的氨基酸混合物(丝氨酸,亮氨酸,缬氨酸).
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