B淋巴细胞能够产生抗体,但在体外不能进行无限;而骨髓瘤细胞可以在体外无限传代,但不能产生抗体.将这两种细胞融合后,用一特殊选择培养基(HAT)阻断正常细胞或自体融合细胞的DNA合成通,而杂交瘤细胞可利用补救通合成DNA得以,且既能产生抗体,又能无限增殖,并以此生产抗体的技术.单抗技术是主要由抗原制备,免疫动物,细胞融合,筛选杂交瘤细胞,克隆化培养,单克隆抗体的大量制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统,其核心部分是细胞融合.
细胞融合是单克隆抗体技术的中心环节,基本步骤是将脾细胞和骨髓瘤细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合.
Balb/c小鼠,SP2/0骨髓瘤细胞,50%PEG,不完全培养液,HAT培养液,75%酒精,剪刀,镊子,纱布,离心管,网筛,大小瓶 皿,直头滴管,弯头滴管,瓶塞,培养瓶盖,离心管盖,烧杯(加入37℃水),泡沫板,大头针,96孔培养板,计时器,显微镜,计数板等.
2.用无菌剪刀剪开皮肤,腹膜,剪一小口,用滴管注入5～6ml不完全培养液(严禁刺破肠管).
3.反复冲洗,将冲洗液吸入15ml离心管,1000rpm5min离心,用完全培养液混悬,调整细胞密度.
3.在平皿中的网筛中,用镊子夹取脾脏进行反复研磨,边磨边滴加不完全培养液,直到脾细胞单个化,将细胞悬液转入15ml离心管中.
4.细胞计数.根据两种细胞计数结果,调整悬液用量,配平之后(SP2/0细胞与脾细胞数量比值在1：5～1：10之间),以1000rpm5min离心.
5.弃上清,每管加入5ml不完全培养液,吹打混匀后合并于同一15ml离心管中,再次以1000rpm5min.
一只小鼠可获得(1～2.5)×108个脾细胞,与(2～3)×107个SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合.显微镜下可见单个分散的细胞,细胞培养3～5天后即可出现小克隆,杂交瘤细胞较大,呈圆形且透明,其它细胞透光性差并逐渐死亡.
1.细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:5到1:10不等.应两种细胞在融合前都具有较高活性.
2.培养液的成分：对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、胎牛清、各种离子和营养成分均需严格配制.如融合效率降低,应随时核查培养基情况.
3.PEG对细胞有毒性作用,所以滴加速度及时间至关重要,时间短影响融合,时间长会造成细胞毒性,日后细胞生长不好.
5.融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的,以及适宜的无菌操作技术.
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