免疫荧光：免疫荧光染色技术

　　固定剂 95%～100%乙醇 丙 酮 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 微火加热,甲醇、10%甲醛、丙酮

　　固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光.

　　(1)将固定好的玻片置于湿盘中,滴加荧光抗体染色液,以覆盖为度,加盖,37℃感做30 min～45min.

　　(1) 检查抗原：①取固定标本,加已知的免疫血清,37℃孵育30min;②以PBS液3×3冲洗;③再加荧光标记的抗抗体,37℃孵育30min;④PBS 3×3冲洗;⑤H2O冲洗,凉干;⑥加甘油缓冲液,封片、镜检.

　　(2)检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片,自然干燥,甲醇固定;②滴加相应抗原液(按1:100～1:500稀释),37℃孵育30min;③PBS液3×3冲洗;④加荧光抗体,37℃孵育30min;⑤PBS液3×3冲洗;⑥水洗,凉干;⑦加甘油缓冲液,封片、镜检.

　　荧光显微镜所观察到的图象,主要以两个指标判断结果,一个是形态学特征;另一个是荧光的亮度,在结果的判定中,必须将二者结合起来,综合判定.

　　荧光强度的表示方法如下：+++ ～ ++++：荧光闪亮,呈明显的亮绿色.++ ：荧亮,呈黄绿色.+ ：荧光较弱,但清楚可见.± ：极弱的可疑荧光.- ：无荧光.

　　由于荧光色素和蛋白质的稳定性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和性.因此给标本的保存带来一定的困难,所以在标本进行荧光染色之后应立即观察.

　　保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存,随用随染;②染色片采取优质封固剂,如特别的荧光封固剂(Fluormount)或碱性优质纯甘油固剂等封固.这些封固剂能防止荧光激发,封固后低温保存;④可以采用拍照保存照片.