摘要：ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术.常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法.
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA):是酶免疫测定技术中应用最广的技术.其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 )表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除.常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大抗原,后者用于测定抗体.
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA).在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA.
本法主要用于检测抗体.以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下:
(3)结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性.
本法主要用于检测大抗原.现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序.
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的性.
③ 加用非同种动物生产的性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量.此法的优点在于快速、性高、且可用于小抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记,而且因为抗原的结构不同,还需应用不同的结合方法.此外,试验中应用酶标抗原的量较多.
本法主要用于检测型性抗体.该方法现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测方法.
本法主要用于检测IgM抗体.由于IgM抗体出现于感染早期,所以检测出IgM,则可作为某种疾病的早期诊断.抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种,其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性,该方法的主要程序为:
① 用抗u链(抗IgM重链)抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜,洗涤三次、抛干
与常规的微量板ELISA比较,Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点,而且结果可长期保存;但其也有不足,主要是在结果判定上比较主观,性不够高等.该方法的主要操作程序为:
(1)载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后,稍加干燥进行压圈.将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中,置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥.每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40-53个样品,每个压圈可加抗原液1-20μl.
(2)封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中,37℃感作15-30分钟.封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS.
(3)加被检血清 可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置于微量板孔中,再加入一定量适度稀释的待检血清,37℃反应一定时间,用洗涤液洗三次,每次1-3分钟.洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液.
(6)结果判定 以阳性、血清作为对照,膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应,否则为阴性反应.
C-ELISA(Cloth-ELISA)是学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术.该方法是以疏水性聚脂布(Hydrophobic Polyester Cloth)即涤纶布为固相载体,这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大,可为免疫反应提供较大的表面积,提高反应的性,且容易洗涤,不需特殊仪器等优点.其基本原理与Dot-ELISA类似,只是载体不同.以对布氏杆菌抗原的检测为例,C-ELISA的主要程序为:
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