(3)除去检查的抗原以外,组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原),可与组织中性抗原以外之之相应抗体结合.
(4)从组织中难于提纯抗原性物质,所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体,以致容易混淆.
(5)抗体上标记的荧光素太多,这种过量标记的抗体带过多的阴离子,可吸附于正常组织上而呈现非性染色.
常用肝粉(猪、大白鼠或小白鼠),其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等.每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀,在室温中振动2h,4℃中过夜,再搅拌10min,高速离心(3000～15000r/min)30min,1～2次后,即可使用其上清液.吸收一般应在临用前进行,吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周.染色应作吸收前后之比较,吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿,离心(3000～15000r/min)30min,除去上清液,再加入荧光抗体进行吸收,以免消耗过多的抗体.
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非性的消除方法,对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用.如检查组织中的病毒抗原时,也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之.
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多,如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液,用生理盐水洗2～3次,12000r/min 10min离心沉淀,用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的,京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没失,他们常用此法,效果甚佳,吸收后放置一周左右,用时有必要再吸收一次.
(1)将若干只小白鼠或大白鼠放血,取出肝脏,用生理盐水洗2～3次,除去血液,剥掉表面的结缔组织的脂肪.
(2)剪碎,用生理盐水反复洗涤至无血色止,然后再加生理盐水少许,用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆.
(3)将肝匀浆装入离心管内(1/3左右),交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次,至上清无血色止,每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后,再除去上清液.
(4)最后用丙酮洗涤肝浆,再用布氏漏斗过滤,或离心沉淀,将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上,37℃烤干(过夜).
荧光素如FITC可以通过半透膜,而蛋白质大不能透过,可将未与蛋白结合的荧光素透析除去.
(2)浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中(悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内),在4℃中透析,每日更换3～4次PBS,约5～7天,透析液中无荧即可(在荧光光源照射下).
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法,详细方法第二章.加入荧光抗体15～18ml(按床体积的5%～10%加样),使其缓慢渗入柱内,待即将全部入柱时,加入PBS少许,关闭下口,停留30～40min ,使游离荧光充分进入细筛孔中,然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液.加入洗脱液一定量后,荧光抗体即向下移行,逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉显的界线,随着大量洗脱液的不断加入,二者分离距离越来越大,荧光抗体最先流出,分前、中、后三部分收集,测F/P比值,合格者合并,浓缩,分装.洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白(发生沉淀反应),继续洗脱,游离荧光素则相继被洗脱下来,至洗脱液中无蛋白和荧光素后,此层析柱即可再用.
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类,可先在过柱前透析一夜,否则,NH4+太浓,在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+,因而影响提纯与回收蛋白,一般待洗脱液出现蛋白时,即进行收集,之后出现SO4++(用1%BaCl2检查发生白色沉淀).最后是NH4+,(用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀),待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用.
DEAE-纤维素柱的装柱,洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同.装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜.常用梯度洗脱法如下:
(1)层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡,标记物上柱后,先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱,洗出无色或淡绿色液体,洗脱液量(根据床体积大小每梯度乘3),然后依下列各种离子强度洗脱液,分别洗脱和收集:
将此三部分收集液(每管5ml)分别测定其F/P比值,0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并,浓缩保存备用.因这部分非性染色荧光最少,是比较好的荧光抗体.其他两部分可以废弃.
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体,其抗体量一般约损失50%,因此有些要求不太高的抗体,如抗细菌荧光抗体,不一定要这样处理,可用染色效价测定的稀释法除去非性染色.
先测定荧光抗体性染色与非性染色的效价,若二者效价相差较大,则可将荧光抗体稀释至一临界浓度,使性染色呈阳性,而使非性染色保持阴性,稀释方法和染色效价测定方法相同.
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价性抗体的最主要条件.近代免疫化学技术(免疫吸收法)和柱层析法等提供了很大的可能性,可参考有关专著.
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法.如分泌型IgA(SIgA)抗原纯度不高,所制的抗血清常与IgG呈交叉反应,为此需要吸收,常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化.方法如下:
2.免疫吸收法将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液,置室温搅拌60min,离心沉淀,上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清.如用IgG聚合物作少量分次吸收,其效果更好.
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l pH7.2PBS稀释荧光抗体,可将背景细胞和组织染色,呈红色荧光,与性黄绿色荧光形成鲜明的对比,减少了非性荧光,宜作常规应用.伊文氏蓝一般先配成1%溶液,保存于4℃,用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体.
此外,还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非性染色,提高性染色.
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