1、染色:切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥.
2、洗片:倾去存留的荧光抗体,将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶.
②染色试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片.结果应为阴性.为证明此种染色不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,染色结果应为阳性.此法结果较二步法稳定.
直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究.此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,性高而性较低.
(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min.然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体.
(2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检.
间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method).另一种称夹心法,即用未标记的性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验.
(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers 盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8…….补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色.免疫血清补体结合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释.
(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用.Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度.
(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为1:4,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用.
(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内.
(3)灭活补体对照:将补体经56℃30min处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色.
本法之荧光抗体不受免疫血清的动属的,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想.
本法应用直接法或间接法的原理和步骤,可对活细胞在试管内进行染色,常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究,阳性荧光主要在细胞膜上.FACS即采用此法原理.
在同一标本上有两个抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原),A抗原的抗体用FITC标记,B抗原的抗体用罗达明标记,可采用以下染色方法:
2、二步法双染色:先用RB200标记的B抗体染色,不必洗去,再用FITC标记的A抗体染色,按间接法进行.
若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后,未获得阳性结果,而又疑有另外的病原体存在时,可用相应的荧光抗体再染色.
有时存档蜡块不能再用以切片,也可用存档的HE染色标本,褪去盖片和颜色,再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色.
某些抗原可以用荧光素标记,制成荧光抗原,标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同.用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体,性较好,性较差.染色方法同荧光抗体染色的直接法.由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵,一般很少采用此法.
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