4℃保存,Hoechst 33258染色液需4℃避光保存.本试剂盒自订购之日起六个月内有效.
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍.将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满.
B. 刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜).
C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体.洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次.
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免气泡.使细胞接触封片液,切勿弄反.
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核.激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,详细图谱请参考下图.
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜).
C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀.
A. 对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,即可进行后续的Hoechst染色.
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体.洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次.可在六孔板中操作.
F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核.激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,
DAPI dilactate更水溶.在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时,下述方法可加以修改.
AM酯的羧酸经修改不带电荷,易浸入细胞.一旦进入细胞,亲脂性集团被非酯酶切断,使其带电荷,从而溢出细胞大大减慢.一般,酯化集团水解对于结合靶离子是必须的.AM酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解.
剂干燥避光4℃或-20℃可长期保存.AM酯易水解,发货瓶中至少可放六个月.用时AM应溶解于无水DMSO,并尽快使用(一周内),否则细胞运载能力下降.AM的DMSO储备液应避光、冷冻、干燥保存.盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备,冷冻-20℃避光保存,可放6个月.
3.AM酯孵育细胞一般在20-37℃,15-60分钟,准确的浓度,时间和温度靠经验摸索.AM酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂,降低孵育温度可以减轻这一副作用.
4.检测荧光前,细胞最好在无剂媒介中(最好有阴离子转运剂)洗,以去掉细胞表面的非吸附的染料.而后再孵育30分钟来进一步使细胞内AM酯完全脱掉.荧光素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止.
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