摘要：胶体金是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液.良好的胶体金应该是清亮透明的,下文就介绍制备免疫胶体金.
胶体金(colloidalgold)也称金溶胶(goldsol),是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液.胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12-),外层离子层H+则分散在胶体间溶液中,以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态.胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于30nm以上的)多呈椭圆形.在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态.
1.胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm,微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中,成为胶体金溶液.胶体金因而具有胶体的多种特性,特别是对电解质的性.电解质能胶体金颗粒的外周永水化层,从而打破胶体的稳定状态,使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒,而从液体中沉淀下来.某些蛋白质等大物质有胶体金、加强其稳定性的作用.
2.呈色性微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别.最小的胶体金(2～5nm)是橙的,中等大小的胶体金(10～20nm)是酒红色的,较大颗粒的胶体金(30～80nm)则是紫红色的.根据这一特点,用观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小.
3.光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的波长(λmax)在510～550nm范围内,随胶体金颗粒大小而变化,大颗粒胶体金的λmax偏向长波长,反之,小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长.
1.制备方法胶体金的制备多采用还原法.氯金酸(HauC14)是主要还原材料,常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等.根据还原剂类型以及还原作用的强弱,可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金.最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法.具体操作方法如下:
(3)继续加热煮沸15min.此时可观察到淡的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成红色.全过程约2～3min.
用此法可制备16～147nm粒径的胶体金.金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量.表1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量.
(4)是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净.最好是经硅化处理的,硅化方法可用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟,用蒸馏水冲净后干燥备用.
(5)胶体金的鉴定和保存:胶体金的制备并不难,但要制好高质量的胶体金却也并非易事.因此对每次制好的胶体金应加以检定,主要检查指标有颗粒大小,粒径的均一程度及有无凝集颗粒等.
观察是最基本也是最简单和方便的检定方法,但需要一定的经验.良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒.在日光下仔细观察比较胶体金的颜色,可以粗略估计制得的金颗粒的大小.当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径.结制备的胶体金最好作电镜观察,并选一些代表性的作显微摄影,可以比较精确地测定胶体金的平均粒径.
胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存,加入少许防腐剂(如0.02%NaN3)可有利于保存.保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成.少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记,使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒.
胶体金可以和蛋白质等各种大物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针.用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold).
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的.胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电相附.因此pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附.
1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值.原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱.但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定. 在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再胶体金的pH值.
2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2～5min.由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐.
5.轻吸上清液.沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心.如此洗涤2～4次.以彻底除去未结合的蛋白质.
6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存.稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液.缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液.
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂.稳定剂有两大作用:一为胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非性吸附反应.稳定剂的合理选择是十分重要的,不适当的稳定剂有时也会导致非性反应.
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