摘要：生物素-亲合素系统是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统.目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术.
生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统.随着各种生物素衍生物的问世,BAS很快被广泛应用于医学各领域.1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点,建立了标记亲合素和生物素法(LAB/BA)与桥联亲合素—生物素技术(BRAB).1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法(ABC法).近年大量研究,生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合,如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、SPA等.生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应,使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏.BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术.
生物素又称维生素H,多从含量较高的卵黄(α型)及肝组织(β型)中提取,亦可人工合成.生物素量为244.31,式为 C10H16O3N2S,pI为3.5,是羧基酶作用的一种辅酶,故又称辅酶R,具有α、β两型,其生物活性基本相同.生物素环形结构中的I环为咪唑酮环(又称Ureido环)(I环),是与亲合素结合的主要部位;生物素的Ⅱ环结构为噻吩环,带有一个戊酸侧链,末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构.抗体经生物素化后,其结合抗原的活性不受影响.多种酶结生物素化后,其催化力保持不变或稍有降低.因此生物素可与多种标记物结合,适用于多种免疫检测技术.
亲合素主要包括卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等.后两种因其性亲合力低,研究不多,前两种目前已深入研究并得到广泛应用.
1、亲和素(Avidin;A) 亲合素又称卵白蛋白或抗生物素,量为68000,pI 10～10.5;在pH 9～13缓冲液中性质均稳定,耐热并耐多种蛋白水解酶的作用.天然亲合素为碱性蛋白,由4个相同的亚单位构成4聚体;每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环结合.因此,1个亲合素存在4个与生物素结合位点,其结合(Ka)高达1015mol/L.
通常,亲合素的活性单位是以亲合素结合生物素的量来表示的,即以能结合1Pg生物素所需要的亲合素量为1个亲合素活性单位.一般1Pg亲合素约含13～15个活性单位.
2、链霉亲合素(Streptavidin,SA) 链霉亲合素(SA)是与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质.是由Streptomyces avidin菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物,SA也可通过基因工程手段生产.SA量为65000,由4条序列相同的肽链构成,每条SA肽链可以结合1个生物素.因此与A一样,每个SA也具有4个可与生物素结合位点,其结合与A相同为1015mol/L.约为抗原抗体间Ka (105～1011 mol/L)的1万倍以上.
SA与A的ka虽然相同,但在实际应用中其检测灵敏度明显优于A,其原因是SA为略偏酸性的蛋白.SA的每条肽链含159个氨基酸残基,其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比一般亲合素少,反之含酸性氨基酸较多,其等点为6.0,较A(pI=10)为低,同时在结构中SA不含任何糖基,而A含糖可高达10%.A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时,易产生一定程度的非性结合,造成较高的显色背景,而SA较A在应用中明显克服了这一缺点.
SA最高的活性可达18u,较A高(15u);与A一样,每个SA也具有4个可与生物素结合位点,故其效应相同.
生物素-亲合素不仅可与多种标记物稳定结合,而且能偶联抗体等大物质,因此建立了许多检测方法,成为免疫学、生物学领域中广泛应用的新技术系统之一.
1、高度性 生物素-亲合素系统的结合反应因其亲合力极高而呈现高度性,生物素、亲合素一旦结合则很难分离,这种高度、稳定地结合,使反应试剂可经得起高度稀释,因而可明显降低或避免了反应中可能存在的非性作用.
2、高度灵敏性 亲合素可通过4个结合位点多价桥联生物素的反应物和标记物.另外,生物素化的大蛋白、核酸、酶等物质不仅保持其活性不受影响,更因生物素化形成许多"触手"的多价制剂,使整个反应体系出现多级放大效应,因而赋予BAS极高的灵敏性.
3、简易、快速、安全、稳定、BAS的高度性及灵敏性,使其在反应体系应用中用量极微,故成本低廉.反应程序于数小时即完成,结果易观察.生物素标记试剂可于4℃存放两年而效价不变.
4、应用广泛 BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系,也可作为亲合介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化.近年研究提出,生物素亲合素系统尚可作为均相酶免疫试验中高效的酶活性调变系统及新型的标记生物免疫传感器系统,因此,BAS有着极广的研究与应用潜力.
最新评论