摘要：比较流式细胞仪分选,免疫磁珠分选及亲和板结合分离法分选c kit+肝癌细胞的效果,以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法.
肿瘤干细胞研究需要获取高纯度、高活力、高增殖能力的肿瘤亚群细胞,并尽量避免混杂细胞、低活力、低增殖能力细胞对细胞亚群特性的干扰.笔者在前期研究的基础上,比较了流式细胞仪分选(flow cytometry sorting,FCMS)、免疫磁珠分选(magnetic cell sorting,MACS)及亲和板结合分离法(immune panning isolation)3种方法分选c kit+肝癌细胞的效果,以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法,为肿瘤干细胞的研究奠定基础.
1.1.1 标本:取材于南方医科大学附属珠江医院2006年4月经手术切除的肝癌标本,经病理为原发性肝细胞癌.患者术前未进行任何抗肿瘤治疗,手术后患者4周内存活.
1.1.2 实验动物:裸小鼠(BALB/c)75只,雌雄兼用,3～5周龄,质量10～20g,由南方医科大学动物实验中心提供.
1.1.3 主要试剂:低糖、胰蛋白酶、无钙镁离子的平衡盐溶液(D HankS液,pH7.2～7.4)、细胞增殖试剂CCK 8购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;兔抗人c kit多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200)购自丹麦Santa Cruz公司;抗兔IgG1免疫磁珠购自Miltenyi Biotech公司;其他常用试剂为国产分析纯.
1.2.2c kit+肝癌细胞的分选:对数生长期的第8次传代细胞的单细胞悬液,分别以下述3种方法分选c kit+细胞:(1)流式细胞仪分选:按流式细胞仪分选的要求,以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,标记细胞后上机分选,获取c kit-细胞和c kit+细胞.(2)免疫磁珠分选:参考文献方法,以兔抗人c kit多克隆抗体和抗兔IgG1免疫磁珠,严格按照免疫磁珠分选操作规则获取c kit-细胞和c kit+细胞.(3)亲和板结合分离法分选肿瘤细胞:按文献中亲和板结合分离法,以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,分选c kit-细胞和c kit+细胞.每种方法分选出5组细胞,进行如下检测.
(1)细胞活力检测:采用台盼蓝实验检测细胞活力并计算细胞存活率=[活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)]×100%.
(3)c kit+肝癌细胞的纯度:按流式细胞仪检测的要求,以兔抗人c kit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,各组细胞标记后上机检测c kit+肝癌细胞的纯度.计算分选前、后c kit+细胞的百分比.
(5)c kit+亚群肝癌细胞成瘤能力测定:参考文献方法,每个样本接种5只裸鼠,检测3周内生成移植肿瘤的比例.
所有数据采用SPSS 11.5软件分析.多组比较采用One Way ANOVA检验及LSD两两比较,两组之间比较采用样本的t检验.P<0.05为差异有统计学意义.
2.1 流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板分离法分选后c kit+肝癌细胞的纯度、回收率、活力、增殖能力、移植瘤成瘤率对比分析
显示:3种分选方法分选后的c kit+肝癌细胞活力、增殖能力和成瘤率差异无统计学意义(P>0.05),而纯度、回收率差异有统计学意义(P<0.05).进一步两两比较显示:3种分选方法分选后的c kit+肝癌细胞的纯度之间差异均有统计学意义(P<0.05).纯度从高到低依次为流式细胞仪分选,免疫磁珠分选,亲和板结合分选.亲和板结分选c kit+肝癌细胞的回收率低于其他2种分选方法(P<0.05),而流式细胞仪分选与免疫磁珠分选2种方法分选c kit+肝癌细胞的回收率差异无统计学意义(P<0.05).
2.2 流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的活力、增殖能力对比分析显示:流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的活力、增殖能力之间的差异均无统计学意义(P>0.05).
在肿瘤干细胞的研究中,需要按照一定的细胞表面标志抗原将肿瘤细胞分成不同的细胞亚群,再比较各细胞亚群异种移植瘤的成瘤率.为避免混杂细胞对结果的干扰,需要尽可能提高分选后目的细胞的纯度,且不应过多影响分选后细胞的活力、增殖能力和成瘤能力.同时,由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞中所占比例较低,也要求分选后细胞的回收率不应过低.因此,寻找一种分选效率高且不影响分选后细胞的活力、增殖能力和成瘤能力的分选方法对肿瘤干细胞的研究非常重要.
在各种分选方法中,流式细胞仪分选、免疫磁珠分选和亲和板结合分离法分选较为常用.这3种方法在实际应用中各有优缺点:(1)流式细胞仪分选虽纯度较高、回收率高,操作全封闭,污染机会较免疫磁珠分选小,但设备昂贵,技术复杂,需专业技术人员操作,操作费时,适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选.(2)免疫磁珠分选无需昂贵的大型仪器,设备相对便宜,方法简便易行,但分离效率较流式细胞仪分选略低,且耗材相对较贵,适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选.(3)亲和板结合分离法分选成本较低,简便易行,无菌好,无需特殊设备,对细胞活力及增殖能力基本无影响,但细胞纯度和回收率较低,适合对细胞纯度、回收率要求较低的分选.
上述方法在实际研究应用中需根据具体要求进行选择.本文将这3种方法应用于肝癌细胞c kit+细胞的分选中,比较其回收率、分选后细胞的纯度、活力、增殖能力和成瘤能力.本研究发现,亲和板结合分离法的回收率和分选后的细胞纯度最低;流式细胞仪分选所得的细胞活力、增殖能力和成瘤能力与其他2种分选方法所得细胞的相应指标比较,差异无统计学意义,其回收率高于亲和板结合分离法的回收率,与免疫磁珠分选法的回收率差异无统计学意义;而在分选所得细胞的纯度方面,流式细胞仪分选明显高于其他2种分选方法.
综上所述,流式细胞仪分选应用于低含量细胞的分选时,其回收率较高,分选后的细胞纯度最高,且细胞活力、增殖能力和成瘤能力与其他2种分选方法所得细胞的相应指标比较,差异无统计学意义.这说明流式细胞仪分选在较高分选效率的同时,未影响分选后细胞的生物学特性,适用于肿瘤干细胞研究对分选方法的要求.
另外,通过实践,我们认为在流式细胞仪分选中应注意以下几点:(1)选用活力好的细胞进行分选,提高分选效果.(2)各项操作时间尽量缩短,动作轻柔.(3)离心细胞时,速度与时间不宜过快和过长,避免对细胞的损害.(4)接收分选后细胞的培养基中血清含量可适当提高,所得细胞尽快用于进一步移植实验或继续培养.(5)注意操作间的无菌和无菌操作.
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