摘要：可溶性抗原与相应的抗体混合,在电解质存在的条件下,两者比例适合,即可有沉淀物出现,叫沉淀反应.
可溶性抗原与相应的抗体混合,在电解质存在的条件下,两者比例适合,即可有沉淀物出现,叫沉淀反应(Precipitation).由于沉淀反应抗原多系胶体溶液.沉淀物主要是由抗体蛋白所组成.
为了求得抗原与抗体的适宜比例,有足够的抗体,而且抗原小,具有较大的反应面积,因此操作上通常是稀释抗原,不稀释抗体.
沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等.此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法.
当抗原与相应抗体形成一个接触面时,如二者比例适当,接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应.
(3)用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管,加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下,轻浮于血清面上,使成一明显界面,切勿使之相混;
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时,便出现可见的白色沉淀线.这种沉淀线是一组抗原抗体的性复合物.如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时,便依各自扩散速度的差异,在适当部位形成的沉淀线,因此广泛地用于抗原成分的分析.琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验.
(1)将适当稀释(事先滴定)的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板.
(3)向孔内滴加1:2,1:4,1:8,1:16,1:32稀释的参考血清及1:10稀释的待检血清,每孔10微升,此时加入的抗原液面应与琼脂板一平,不得外溢.
(5)测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线,再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量.
(3)用微量进样器于中央孔加抗体,于周围孔加各种抗原.加样时勿使样品外溢或在边缘小气泡,以免影响扩散结果.
(5)结果观察:若凝胶中抗原抗体是性的,则形成抗原—抗体复合物,在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线小时仍未出现沉淀线则为阴性反应.实验时至少要做一阳性对照.出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为线)结果分析:琼脂扩散结果受许多因素影响.
①、抗原性与沉淀线形状的关系:在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时,则可出现两单沉淀线的融合.反之,如相邻抗原完全不同时,则出现沉淀线之交叉;两种抗原部分相同时,则出现沉淀线.
②、抗原浓度与沉淀先导形状的关系:两相邻抗原浓度相同,形成对称相融合的沉淀线;如果两抗原浓度不同,则沉淀线不对称,移向低浓度的一边.见图4.
③、温度对沉淀线的影响:在一定范围内,温度扩散快.通常反应在0-37℃下进行.在双向扩散时,为了减少沉淀线变形并保持其清晰度,可在37℃下形成沉淀线,然后置于室温或冰箱(4℃)中为佳.
⑤、参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响:抗原、抗体相距越远,沉淀线形成的越慢,所以在微量玻片法时,孔间距离以0.25-0.5cm为好,距离远影响反应速度.当然孔距过远,沉淀线的密度过大,容易发生融合,有碍对沉淀线数目的确定.
⑥、时间对沉淀线的影响:沉淀线天出现的数目最多.玻片法可在1-2小时出现,一般观察72小时,放量过久可出现沉淀线重合消失.
对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法.此方法能在短时间内出现结果,故可用于快速诊断,性比双向扩散技术高10-15倍.
血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷,所以在电场作用下都向E极移动.但由于抗体在这样的PH条件下只带微弱的负电荷,而且它的量又较大(为r球蛋白).所以游动慢.更重要的是抗体受电渗作用影响较大,也就是说点渗作用大于它本身的迁移率.所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动.琼脂是一种酸性物质,在碱性缓冲液中进行电泳,它带有负电荷,而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷,这样的液体便向负极移动.抗体就是随着带正电荷的液体向负极移动的.而一般的蛋白质(如血清抗原)也受电渗作用的影响,使泳动速度减慢,但它的电泳迁移率远远大于电渗作用.这样抗原体就达到了定向对流,在两者相遇且比例合适时便形成可见的沉淀线、缓冲琼脂板:将纯化的琼脂用PH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液(用0.05M的巴比妥缓冲液稀释一倍即可)配成1.5%的琼脂,加入0.01-0.02%流柳汞防腐,保存冰箱内备用.
1、琼脂板的制备根据需要可选用大玻板(6厘米×9厘米)和(小玻片)两种.大玻板约需琼脂10毫升,小玻片约需3.5毫升,凝固后按图打孔,方法同琼脂扩散实验.
2、加样:左侧孔内加患者血清(原血清及10倍稀释血清各占一孔),右侧内加抗血清,每片应有阳性对照
用国产普通电泳仪.其内加0.05mPH8.6的巴比妥缓冲液,加至电泳槽高度的三分之二处,注意两槽内液面尽量水平.将加好样品的玻板置于电泳槽上,抗原端接负极,抗体端接正极,用2—4层滤纸浸湿作盐桥,滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米.以板宽度计算电流,以板的长度计算电压.要求电流量为2— 3毫安/厘米,即大板为20毫安,小板为10毫安.电压为4—6伏/厘米.通电45分钟—2小时后观察结果.
在黑色背景上方,用散射光多个角度观察,在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线.如果抗原,两极微沉淀条纹不清晰,于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度.
(1)抗原抗体的比例:抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带,反之不易发生.当抗体浓度恒定时,被检血清含甲胎蛋白浓度高时,作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率.随稀释度的增加,抗原抗体的比例发生变化,沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间,并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形,这些也是阳性,应予注意.
(2)组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高.巴比妥—巴比妥钠次之.Tris缓冲液更差.
(3)电压与电流时电泳时间需要长些:电压电流增大时,电泳时间可更短.但电压过高则孔径变形,电流过大抗原抗体蛋白易变性,干扰实验结果.一般选择每厘米5毫升,电泳时间改为1.5小时.
免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离,然后于凝胶槽中加入抗体血清.使抗原抗体进行双向扩散,在比例适宜部位形成的抗原抗体沉淀弧线.每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物,故可用抗原成分分析;且可以根据其迁移率与抗体所出现的反应进行鉴定.
(1)取载物玻片(7.5ⅹ2.5厘米)加上3.5毫升1.5%琼脂凝胶,制成2毫米厚的琼脂板;
(2)按图,在琼脂板未凝固时,放入抗血清槽铸型,注意勿使铸型全部浸入琼脂中,待凝固时再打孔;
火箭电泳实际是一种定量免疫电泳.其原理为:在电场作用下,抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动,二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线,而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系,因此本法可以测定样品中抗原的含量.
(3)将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原(人血清)分别加入各孔中,每孔10或20微升,要求加量准确而不外溢.
(4)把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳,电压4—6伏/厘米,电泳时间1—5小时,直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火箭状沉淀线)取下琼脂板,以抗原孔中心为起点,量出各火箭状沉淀线的高度.同单向琼脂扩散法绘制标准曲线,查出待检血清中Ig含量.
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