1.性内切酶能地连系于一段被称为性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶正在统一卵白质中兼有切割和润色(甲基化)感化且依赖于ATP 的存正在。Ⅰ类酶连系于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶正在识别位点上切割DNA ,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶构成: 一种为性内切核酸酶(酶),它切割某一的核苷酸序列; 另一种为的甲基化酶,它润色统一识别序列。绝大大都Ⅱ类酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点正在识别序列中,有的正在对称轴处切割,发生平结尾的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位点正在对称轴一侧,发生带有单链凸起结尾的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后发生两个互补的粘性结尾。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"
2.DNA 纯度、缓冲液、温度前提及性内切酶本身城市影响性内切酶的活性。大部门性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入性内切酶储存液中时,会影响其进一步利用,因而正在吸收性内切酶时,每次都要用新的吸管头。若是采用两种性内切酶,必必要留意别离供给各自的最适盐浓度。若两者可用统一缓冲液,则可同时水解。若需要分歧的盐浓度,则低盐浓度的性内切酶必需起首利用,随后调理盐浓度,再用高盐浓度的性内切酶水解。也可正在第一个酶切反映完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置于-70℃低温冰箱内30 分钟，离心、干燥并从头溶于缓冲液后进行第二个酶切反映。
3.DNA 性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列确定的多种性内切酶酶切位点构成，以曲线或环状图式暗示。建立DNA 性内切酶图谱有很多方式。凡是连系利用多种性内切酶，通过度析阐发多种酶单切及分歧组合的多种酶同时切所获得的性片段大小来确定各类酶的酶切位点及其相对。酶切图谱的利用价值依赖于它的精确性和切确程度。正在酶切图谱制做过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。性内切酶的酶解反映最适前提各不不异,各类酶有其响应的酶切缓冲液和最适反映温度(大大都为37℃)。对证粒DNA 酶切反映而言, 性内切酶用量可按尺度系统1μg DNA 加1 单元酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必需添加酶的用量,一般添加2-3 倍,以至更多,反映时间也要恰当耽误。
程度式电泳安拆,电泳仪,台式高速离心计心情, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,系统
1.将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪别离插手DNA1μg 和响应的性内切酶反映10×缓冲液2μl,再插手沉蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后插手1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心计心情甩一 下,使溶液集中正在管底。
2. 混匀反映系统后,将eppendorf 管置于恰当的支撑物上（如插正在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3 小时,使酶切反映完全。
配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶解液取2μl 6×载样液混匀电泳。连结电压正在60-80V，电流正在40mA.电泳竣事后，用EB染色20-25min,紫外灯下察看成果。
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