PCR技术：PCR 引物设计的原则和要点

　　的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发1、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配.引物3端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加.3、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响.不同的末位碱基在错配导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A.另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败.5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引饰位点或标记物.4、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大.5、引物所对应模板序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳.Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T).6、?G 值是指DNA 双链形成所需的能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性.应当选用3端?G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间?G 值相对较高的引物.引物的3端的?G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应.7、引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行.