关于酶切接头设计的问题

　　酶切接头到底是怎么设计的。怎么会有的接头是双链的，有的是单链的。我看到双链的接头一般是与酶切位点相匹配的，但是单链的接头怎么有的还会是一条，有的是两条。比如说EcoR1酶切后，要是单链寡核苷酸接头的话，有的人设计是primer1及primer2，但是这两条接头又不是互补的，怎么回事啊？？有哪位可以帮忙解决一下。另外，这个两个单链寡核苷酸接头要是进行连接的时候，不是随机连接的吗。那到时候扩增时，同样的片段不是会扩增出来不一样的东西。也就是说，要是primer1和primer2的5端与酶切片段的3端结合是一种情况，但是还有一种情况就是primer1和primer2的3端与酶切片段的5端结合。这样子的话岂不是很乱？

　　酶切位点一般都是直接按照载体能够使用的添加。都只是在引物的5’端直接加上酶切位点，然后再添加几个碱基。你上网查一下，一般的碱基添加都有。你说的确实是一个问题，就是5’端和三段的方向性问题。所有最好是用双酶切。如果实在只能单酶切，那就只能通过测序确定哪个连接是正确的。