PCR技术:Taq DNA聚合酶

  Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热线年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的.

  该酶基因全长2496个碱基,编码832个氨基酸,酶蛋白为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75~80℃时每个酶每秒钟可延伸约150个核苷 酸,70℃延伸率大于60个核苷酸/秒,55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性,该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成, 但确有良好的热稳定性,在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时,PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min,40min和5~6min后,仍可 保持50%的活性,实验表明.PCR反应时变性温度为95℃~20sec,50个循环后,Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件,也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆活性, 其作用于类似逆酶.此活性温度一般为65~68℃,有Mn2+存在时,其逆活性 更高.

  aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,该酶的催化活性对Mg2+浓度非常.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板,dNTP的浓度为0.7~0.8mmol/L时,用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min,测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高,此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+过高就酶活性,当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可40~50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度,因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整,优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50~60%,其最适浓度为50mmol/L,高于75mmol/L时明显该酶 的活性.

  低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%),十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%),十二烷基硫酸钠(SDS,小于0.01%)几乎可完全该酶的 活性.而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20,NP-40.和Tritox-100)如>5%时方能 该酶的活性.

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