细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加性的引物所具有的令人满意的特点：
① 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
目的序列上并不存在的附加序列，如位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序 列的混合物。为了增加性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要 在引物的3端使用兼并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引 物不是性针对目的模板。
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态 下，退火温度足够低，以引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温 度的反应以提高性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非性产物的形成。为获得最佳结 果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将 退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的 循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高性。循环开在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到 退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模 板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。
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