增加PCR性：引物设计、退火温度、递减PCR、引物浓度等
① 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。...
PCR技术：PCR常见问题分析与对策
3、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或段的交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及样进枪头等均应...
PCR技术：Taq DNA聚合酶
该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～...
增加PCR的性：primers design 、stability of primers 、tmpature
a. 足够长18-24bp，以性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低性,并且降低产量...
PCR技术：反向PCR技术
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端探针在Southern Blot或染色体步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。...
半定量RT-PCR 具体实验步骤？
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆反应可以使用逆酶，以随机引物、oligo(dT)或基因性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆和PCR在同时为逆和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。...
PCR技术：浅谈PCR方法中常见的污染问题及对策
收集样品的容器最好使用一次性的,如重复使用,应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间;样品存放时要密封严实,以防外溢造成相互间的交叉污染;样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的,以免不同实验样品间相互污染;由于吸样枪污染会导致样品间的污染,也是一个值得注意的问题,由于操作不慎将样品或提取物吸入移液枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取时要十分小心,吸时要慢,吸取尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管,开盖时也容易造成...
PCR技术：PCR技术概论
一、PCR技术简史：1、PCR的最早设想：核酸研究已有100多年的历史,60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:"经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因"....
PCR常见问题及回答
*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。...
PCR技术：PCR技术应用进展
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术....
PCR基础篇（实验总结）
B． 预定PCR仪的使用时间，按照扩增的引物，模板，酶等的要求以及PCR仪的说明正确设定PCR程序，并检查验证。注意，不要把分和秒的单位搞错了。...
什么是bisulfite sequencing PCR, BSP？
1.MSP：DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。DNA的甲基化差异转变为序列差异，设计两对分别针对甲基化与非甲基化等位基因的引物，结合PCR扩增就可以将甲基化与非甲基化等位基因区分开。这种方法灵敏度高，对DNA的质和量需要少。...
PCR基因扩增原理及方法步骤
1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；...
关于酶切接头设计的问题
酶切位点一般都是直接按照载体能够使用的添加。都只是在引物的5’端直接加上酶切位点，然后再添加几个碱基。你上网查一下，一般的碱基添加都有。你说的确实是一个问题，就是5’端和三段的方向性问题。所有最好是用双酶切。如果实在只能单酶切，那就只能通过测序确定哪个连接是正确的。...
双酶切连接反应的经验
3、 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。...