影响PCR的主要因素
在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。...
PCR技术：PCR-SSCP的发展现状
日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分离开.作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检...
实时荧光定量PCR进展及其应用
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以P...
PCR技术：PCR实验室的建立
必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染.前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管.1、PCR实验室试剂的操作:...
PCR技术：PCR用于进化分析
那些把注意力集中在同功酶的分析及细胞核和细胞器DNAs图谱分析上的种群 生物不需要具有更高分辩率的方法。直到如今，要获得比几个典型生物更多的序列数 据都是不现实的。在筛选克隆文库、制作克隆子的图谱及测序上所需的努力过大，以 至对特定进行更多的个体检测是不可能的。聚合酶链瓜在克服了用于进化研究的 传统DNA分析法的局限性。...
PCR技术：PCR产物克隆的四种方法
通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低.因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的3末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3突出一个碱基的DNA.这种DNA的连接效率很低.由于PCR产物的效率通过较高,.在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率.对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X－gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子.另一种提高克隆效率的途径是先用Klen...
增加PCR的保：高保真酶、酶的混合物及其他因素
a. 5-3方向的DNA合成能力,没有3-5方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变...
PCR技术：PCR 引物设计的原则和要点
的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发1、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,...
PCR技术：PCR污染及解决对策
目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:1、标本处理区,包括扩增摸板的制备;2、PCR扩增区,包括反应液的配制和 PCR扩增;3、产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备.各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性.如:标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理.:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区....
PCR技术：PCR 污染解决对策
二、追踪污染源如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染.(一) 设立性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况.选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源.如果以含靶序列的重组质粒为对照,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增.阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR性极高,可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶.此外,每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照,即包括PC...
PCR常见问题及解决方案
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。...
PCR技术：mRNA差异PCR技术
以往，研究基因表达差异的主要方法是双向蛋白质电泳指纹图谱和依赖杂交的筛选技术。这两种技术各有自己的适用范围和优点。蛋白质指纹技术具有很高的灵敏度，可以很方便地区分出不同的表达产物，但往往得不到足够的量来分析和克隆它们的基因；而杂交技术则需要较长的周期和繁琐的步骤，也易发生基因的丢失。所以多年以来，人们一直想找出一种更方便有效的替代方法。...
PCR-聚合酶链反应的进展
迄今各种PCR的实验方法虽然有一些改进变化，但是基本原理是一致的。PCR的主要产物是双链DNA，在目的基因两端设计了两条性的引物，引物的5’末端限定了扩增的目的序列的长度，其长度等于两引物间的距离。在PCR过程中，第一循环扩增产生的DNA大小是不均一的，其长度可以超出两个引物结合部位间距离。在第二循环后，以第一循环产物为模板所扩增出的DNA的长度便固定了，并在以后的循环中以成倍速度积累，成为PCR的产物尽管在每一循环中，以起始的DNA为模板所产生的较长片段的产物也仍在不断的扩增，但它们是以...
PCR技术：PCR问题的总结
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加taq酶或溴乙锭.引物...
查尔酮合成酶基因的克隆
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有、、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万至百万倍，使能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。因此，PCR技术是生物和医学等领域中的一项性创举和里程碑。...