模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。...

1、引物长度一般为15-30个核苷酸,在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物,但最多不超过50个核苷酸.2、碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个；GC含量一般40-60%;GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的性;GC含量太高也易于引发非扩增.3、引物Tm值一般要求：55℃-65℃.计算：对于低于20个碱基的引物,Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算；对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从“最近邻位”的计算方式得到,这也是现有...

1、引物长度一般为15-30个核苷酸,在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物,但最多不超过50个核苷酸.2、碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个；GC含量一般40-60%;GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的性;GC含量太高也易于引发非扩增.3、引物Tm值一般要求：55℃-65℃.计算：对于低于20个碱基的引物,Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算；对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从“最近邻位”的计算方式得到,这也是现有...

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。...

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。...

　　用抗体检测抗原是免疫学的最基本方法，用酶或同位素标记抗体可使检测的性提高，常用的定量检测方法ELISA和RIA均基于标记可以使检测的信号增强。免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的性和性，因此，将与抗原结合的抗体通过连接与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使性高于ELISA和RIA。...

所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。...

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非性产物的竟争等因...

　　是指将质粒DNA或构建的重组子导入细胞的过程。细菌细胞在低温，低渗（CaCl2溶液）中膨胀成球形。混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经42℃短时间热激处理后，促进了细胞吸收DNA复合物。重组质粒宿主细胞后，还需要对菌落进行筛选鉴定，通过α互补进行筛选是最常用的鉴定方法之一。...

性指的是在PCR扩增过程中,性地扩增目的片段而非其他片段的性 能.在PCR实验本身的灵敏度很高,且实验条件未充分优化的情况,通常会在目的片段出现的同时伴随有其他的杂带,即发生非性扩增的现象.模板、引物性质及质量、反应条件的控制等均会影响PCR扩增的性.近年来的研究结果表明,缓冲液的品质（如离子种类与组成,反应优化剂等）对PCR的性扩 增起着不可忽视的作用.一般的缓冲液中调节氢键作用的盐只有KCl,而东盛HSTM TaqMix的缓冲体系通过反应优化剂以及KCl/(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节,显著提高...

2.DNA 纯度、缓冲液、温度前提及性内切酶本身城市影响性内切酶的活性。大部门性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入性内切酶储存液中时,会影响其进一步利用,因而正在吸收性内切酶时,每次都要用新的吸管头。若是采用两种性内切酶,必必要留意别离供给各自的最适盐浓度。若两者可用统一缓冲液,则可同时水解。若需要分歧的盐浓度,则低盐浓度的性内切酶必需起首利用,随后调理盐浓度,再用高盐浓度的性内切酶水解。也可正在第一个酶切反映完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc 和2倍...