孕期14-17天SD大鼠,用戊巴比妥(65mg/kg)腹膜下注射麻醉,腹部用75%乙醇消毒后,打开腹腔,取出子宫,小心的剪开子宫取出胎鼠.
经1000r/min离心5min后,弃去上清,沉淀细胞中加入细胞分散液,用吸管吹打分散,制成单细胞悬液.
为了获得神经嵴干细胞,将分离的坐骨神经细胞悬浮于1：2000稀释的P0单克隆的抗体(P07)中,置冰浴20-25min,经离心漂洗后,再与藻红蛋白偶联的抗小鼠IgG1二抗反应.细胞经离心漂洗后,再与偶联荧光素的抗P75IgG抗体(192)反应,细胞经漂洗后,用含有2ug/ml7-氨基放线-AAD)的培养基进行活细胞染色.
细胞接种于用多聚D-赖氨酸和0.15mg/ml人纤黏连蛋白包被的6孔培养板,加入生长培养基2ml,置37℃含6%CO2及饱和湿度的培养箱中培养.
在上述培养系统中,分离的细胞在4天之后经免疫染色,可见有外周神经元、施万细胞和平滑肌样的肌纤维母细胞.P75+的细胞具有多向分化的潜能,但若p0蛋白表达也为阳性的细胞则多向分化的能力降低,而p75-/p0+的细胞则只能分化成施万细胞和肌纤维母细胞,p75-/p0-的细胞只能分化成肌纤维母细胞.因此要从坐骨神经获得神经嵴干细胞必须分选p75+的细胞.在培养时使用16nmol/L BMP2,能加速神经元的分化并增加神经元的比例.若使用1nmol/L胶质细胞生长因子(NRG1),在培养14天后,95%以上细胞分化为施万细胞,而未见有神经元的存在.而若使用TGF-β,细胞的存在能力欠佳,但存活的细胞中SMA阳性的肌纤维母细胞比例很高.
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