神经组织主要由神经细胞(神经元)和神经胶质细胞组成.神经元为高度分化的细胞,已失去增值能力,对条件要求高,只有在适宜情况下,进过特殊处理的器皿中方可生长.如接种在胶原层上,神经轴突在胶原和聚L-赖氨酸溶液中可以生长,有时需加入神经生长因子(NGF)和胶质细胞因子,才能旺盛生长,可出现一定程度的分化,长出突起,但却难以增殖,即使培养胚胎组织情况也是如此.对神经元细胞的培养尚待深入研究.
神经胶质细胞较易培养,它分为少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞三种.神经胶质细胞与神经元有共存关系,少突胶质细胞产生丰富的髓磷质,助于神经元兴奋传导,成熟的少突胶质细胞也无增值能力,星形胶质细胞有多种功能,调节神经元兴奋时产生的因子,可提供神经元营养,并能产生促神经元发展和完成功能活动的细胞因子,在朋友培养中有增值能力.以上说明,神经胶质细胞度神经元的存在和功能活动是十分重要的,也提示阐明神经胶质细胞的功能活动有利于神经元的培养.
从出生4-8天的大鼠脑组织取材培养,培养基中加入胞嘧啶阿拉伯糖非神经细胞,可获得特征明显的脑神经细胞.
基本方法是取新生大鼠脑,切成小块,用无钙、镁离子的PBS洗2-3次,用胰蛋白酶37℃消化15min.将细胞悬液洗涤后接种于聚L-赖氨酸覆盖内表面的培养器皿内进行培养,体方法如下.
(2)硅化吸管机滴管：用无离子蒸馏水稀释硅胶液,使浓度达0.1%-1%,将吸管浸入该溶液中,或用溶液冲洗内面,空气干燥或100℃干燥数分钟,消毒备用.
(3)聚L-赖氨酸处理培养皿：用蒸馏水融解聚L-赖氨酸(10mg/L),过滤除菌,给每个3.5cm培养皿中加入1ml溶液静置10-15min后,除去溶液,加入适量培养基,将培养皿放入培养箱至少2h,以利接种细胞核培养.
●放入无钙.镁离子的PBS(含100 U/L青霉素、100ug/ml链霉素)中洗3次(采用沉降法),每次洗涤胡使组织充分沉降到管底,弃去洗液.
●于试管中加入0.025%胰蛋白酶,作用片刻(5min),再加入完全培养基以终止胰蛋白酶作用.
●将上述混悬液通过硅化的Pasteur滴管,充分捣碎细胞至得到单细胞悬液为止.也可逐步胰蛋白酶消化,通过尼龙筛过滤获得单细胞悬液.
●培养2-4天后,用含5-10umol/L胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养30min,然后改用常规培养基.
神经细胞贴壁生长时,可用神经元烯醇性抗体或破伤风毒素作为标记物,经免疫细胞化学检测科判定神经细胞.用胶原纤维酸性蛋白作为标记物,可判断混杂在其中的胶质细胞.
与神经细胞相比,神经胶质细胞较容易在体外培养生长,用常规的组织块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都可从幼年或成年动物及人的脑组织标本中培养出神经胶质细胞,而且生长稳定,不易发生自发,可建立起能传代的二倍体细胞系.具体方法如下.
●将取下的脑组织于另一培养皿中用Hanks液(含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素)洗2-3次.移入三角烧瓶中,加入40倍体积的Hanks液,用吸管捣碎和反复吹打,由于脑组织很软,反复吹打可制备成单细胞悬液.
●将瓶中单细胞悬液倾斜静置10min或将悬液移入离心管中静置10min,此时细胞和细胞团块自然下沉,脂肪等杂物漂浮于悬液表层,吸出上清,如此反复2-3次可获得较多的细胞.
●在本次沉降物中加入适量培养基,混匀后通过纱网或4层纱布过滤,收集细胞悬液计数,调整细胞浓度,以104-106个/cm2浓度接种到培养瓶(或皿)中,置37℃、5%CO2常规培养.
神经胶质细胞贴壁过程缓慢初期生长慢,短期内也可能不见细胞.细胞适应的过程较长,一但贴壁生长后,增殖旺盛,培养初期常混有成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞等,经过数次传代后,这些混杂细胞消失,逐渐形成均一的单层生长的星形胶质细胞,但所形成单层的连接不紧密.
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