检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外,还可用四唑盐比色法试验(MTT).此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中,而细胞无此功能.二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物,用酶联免疫检测,以在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比.
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1 x10^9个/L的但细胞悬液,将细胞接种于96孔培养板中,每孔100ul.
●培养3-5天后,每孔加入MTT溶液10ul,继续置培养箱孵育3-6h,终止培养,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培养数小时,将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解.
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度(OD),选波长490nm.以时间为横轴,OD值为纵轴绘制细胞生长曲线.
用此法测细胞活力,为结果的准确性,最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,再确定每孔细胞接种数和培养时间,以培养终止时不会过满.另外,实验时设空白对照,比色时,以空白孔调零.
基本原理为：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合,在595nm波长处呈最大吸收,其OD值与蛋白质含量成正比.主要用于测定妹、受体及细胞外代谢物的性活性.
●用0.25%胰蛋白酶消化细胞,制成悬液,用含10%胎牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为1×104个/ml,接种24孔培养板,每孔1ml,置37℃、5%CO2条件下培养一段时间.
●用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值.以溶剂为空白对照,以已知量的牛血清蛋白为标准品,绘制标准曲线.然后根据曲线推算样品中蛋白质含量.
基本原理为：细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸,用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中,通过测定细胞的放射性强度,可了解细胞蛋白质合成代谢情况.
●取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中,调整细胞密度107-109个/L,接种于24孔培养板,每孔1ml.
●将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时,每孔100ul预温37℃的3H-亮氨酸.
●终止培养,取出培养板,小心吸取培养上清,用预冷的PBS洗涤,晾干.如果细胞松散,可先用甲醇固定10min.
●把培养板放在冰盖上,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,吸取上清.
●混匀,移入闪烁液,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示.
基本原理为：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基,也是DNA合成的必需物质.用同位素3H标记即3H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程中,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况.
●取对数生长期细胞,制成3 X 10^8个/L的细胞悬液,接种于24孔培养板中,每孔1ml.
●终止培养,小心吸弃上清,用HBSS漂洗单层细胞2次,然后加入2mo预冷的10%TCA,放置10min.如果细胞松散,应先用固定甲醇10min,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数,结果以cpm/10^6细胞表示.
●终止培养,将细胞收集于49型滤膜上,如为贴壁细胞,吸弃培养上清后,用0.25%胰蛋白酶消化2-5min;如为血细胞,先用蒸馏水破红细胞.然后再收集细胞,收集后要加10%CTA和甲醇固定.
●将滤膜烘干后移入已知有3min闪烁液的闪烁瓶中,在液体闪烁计数仪上测定每分钟脉冲数或衰变数,结果以cpm/10^6细胞或dpm/10^6细胞表示.
用流式细胞仪测定细胞增殖周期和DNA合成是20世纪90年代发展起来的新手段,不仅快速、准确、效果好,而且消除了同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染.
●取80%汇合至接近完全汇合的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,制备成单细胞悬液,细胞密度1想0^9个/L,注意不要留有细胞碎片.
●进行流式细胞仪检测.除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成外,还可了解染色体倍性;结合荧光免疫法,还可对细胞膜进行分析等.
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