1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线分钟.开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部.
3、处理组织：把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟.
4、剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化.加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞.
5、消化：或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好.消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定.
6、分离：在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块.低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液.
7、计数：用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中.对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整.
8、培养：置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞.
1、剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止.
2、：用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可20~30块.
3、轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸.
4、培养：从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块.置温箱中静止培养.待细胞从组织块游出数量增多后.再补加培养液.
4、吸除消化液,向瓶内注入Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶,把消化液冲掉.注意加Hanks液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液冲洗,直接加入培养液.
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