①二倍体二细胞胚胎准备:采用8-12周龄的雌性小鼠,第0天约5:00PM注射10 U/只 PMSG;48小时后注射10 U/只HCG,然后将雌鼠与雄鼠合笼;第二天早上检查阴栓,检出有阴栓的雌鼠记为0.5 dpc(days post coit um);在1.5 dpc处死见栓雌鼠,剪取完整输卵管部分,用装有H-CZB的钝针头插入输卵管的伞口部分,用H-CZB冲输卵管,然后收集受精二细胞胚胎,收集好的二细胞胚胎在CZB培养液中培养,37℃,5% CO2。
②电融合:电融合仪采用Eppendorf公司产品(Multiporator),电融合模式设为II型,首先将受精二细胞胚胎用电融合液清洗至少3遍,然后将二细胞依次排列在电融合槽内两个电极之间,每次排列约排列15-20个胚胎,点击开始按钮后,完成电融合过程;将进行电融合操作后的胚胎用HCZB清洗至少三遍以上,放入CZB培养液中培养,(37℃,5% CO2),电融合槽要用蒸馏水至少清理5遍以上;电融合结束后一个小时观察融合结果;将融合的胚胎,继续培养,约培养48小时至54小时后,即可发育成四倍体囊胚,用于四倍体补偿操作。
③假孕鼠准备:挑取自然发情雌鼠,与结扎雄鼠合笼交配。在第二天检阴栓,检出阴栓的雌鼠记为0.5 dpc;继续饲养至2.5 dpc,子宫就可以用做受体,进行胚胎移植。
④显微操作:用持卵针固定好四倍体囊胚,吸取靠近ICM部分,使ICM部分大约固定在9点上;用平口注射针吸取约10-15个供体细胞,从3点进针,抵住囊胚透明带及层细胞与细胞间的连接处,用Piezo给电脉冲,使注射针进入囊胚腔,将供体细胞吐出在ICM上。操作完成后的胚胎放在含葡萄糖的CZB培养液中培养。(37℃,5% CO2)。
⑤胚胎移植:显微操作完成的胚胎,培养箱中继续培养1-2小时后进行胚胎移植;将2.5 d假孕鼠麻醉后,进行手术,将扩展的囊胚移入子宫角内,每侧子宫移植10-12个胚胎;手术后的小鼠送回鼠房继续培养,17天后,即假孕鼠的第19.5 dpc自然生产或产。
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