2、移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟.注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份.
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散.不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样.胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时,胰酶溶液的作用能力最强.使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤.因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ,如： D-Hanks 液.终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶剂终止胰酶对细胞的作用.
1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 %,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右)或 PBS ( D-hanks )液中.搅拌混匀,置于 4℃ 内过夜.
2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器( 0.22 微米微孔滤膜)抽滤除菌.然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用.
2、具体操作均在超净台内完成.青霉素是 80 万单位 / 瓶,用注射器加 4ml 灭菌双蒸水.链霉素是 100 万单位 / 瓶,加 5ml 灭菌双蒸水,即每毫升各为 20 万单位.
3、使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml . 1 单位= 1 微克?
6、培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通 过污染测试后,大量培养时则不加抗生素.
1、溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml .然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右.最后定容至 1000ml ,摇匀.
2、安装蔡式滤器：安装时先装好支架,按放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好.然后卸下支架腿分别用布包好待消毒.
1、血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在 56℃ 水浴中灭火 30 分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用.
血清必须贮存于–20 ～ -70 ℃,若存放于4℃,请勿超过一个月.如果一次无法用完一 瓶,可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %,必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形.
2、一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤.若发现血清有许多悬浮物,则可将血清入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清.
3、瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天,至室 温下全溶后再分装,一般 50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml.在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡 ,使温度与成分均一,减少沈淀的发生.勿直接由-20 ℃ 直接 至37 ℃ 解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀.
5、勿将血清置于37 ℃太久,若在37 ℃ 放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到,而影响血清之品质.6、血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本 身之品质.若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤.不用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜.
6.2.显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多.有些沈淀物在显微镜下观察像是 小黑点 ,常会误认为血清遭受污染,而将血清 放在37 ℃中欲培养此微生物“,但在37 ℃ 下,又会使此沈淀物增多,更 会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染.一般而言,此黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品应立即停用,更换另一批号的血清.
注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L .如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中,过滤除菌后可完全( 20ml )加入 1L 培养液中,或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可.
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡.在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺.由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定, 4℃ 下放置 1 周可分解 50 %,故应单独配制,置于 -20℃ 冰箱中保存,用前加入培养液.加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺.一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 ～ 4mmol/L .可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液.配制方法为,谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶, -20℃ 保存,使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液.
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml .因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为 0.56 克 / 瓶,配制时,可将其溶于 100ml 三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为 ℃ .使用时,向 100ml 培养液中加入 1ml (精确可加入 0.9ml )即可.
0.1 %Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌.注意：因为Ⅰ型胶原酶颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌.分装入 10ml 小瓶 -20℃ 保存.
因为明胶难于过滤,所以配制 0.1 %明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制.所以制备过程中必须要注意无菌操作.首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克 (配成 100ml 溶液) — 即解决无菌分装药品的问题.其次要注意即使是 01. 的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入 50ml 小瓶中, 4℃ 保存.
2、安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张,放置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上.
3、配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了培养液 PH 值最终为 7.2 ,可在配制时调 PH 至 7.4 .
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